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Endotoxinas: el culpable misterioso que provoca fiebre en las vacunas.

Pruebas LAL un factor clave.

¿Por qué da fiebre con algunas vacunas? A lo largo de la historia los productos de área médica, la bioingeniería e incluso la terapia celular se encuentran sujetos al peligro de contaminación por endotoxinas bacterianas, las cuales pueden provocar respuestas inmunitarias severas en el organismo. Es por ello que la evaluación dentro de los procesos de control de calidad es fundamental para evitar la contaminación en productos farmacéuticos., es aquí donde la prueba LAL (Lisado de Amebocitos de Limulus) se ha convertido en el estándar por excelencia para detectar y cuantificar la presencia de endotoxinas, principalmente en dispositivos médicos e inyectables, asegurando así la inocuidad y calidad en la manufactura de los productos.

¿Qué son las endotoxinas?

Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS) que forman parte de la membrana externa de bacterias Gram negativas como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhi. Estas moléculas cumplen un papel estructural en la bacteria, proporcionando estabilidad a la membrana. Cuando las bacterias se desintegran o se multiplican, las endotoxinas se liberan al entorno, provocando efectos tóxicos al ser reconocidas por los anticuerpos y el sistema de defensa del hospedero.

Desde el punto de vista químico, las endotoxinas se componen de tres partes:

Lípido A: La porción tóxica que interactúa con el sistema inmune humano.

Núcleo polisacárido: Una cadena corta de azúcares que conecta el lípido A con el antígeno O.

Antígeno O: Una cadena de polisacáridos que varía entre especies bacterianas y genera respuestas inmunológicas específicas.

Efectos de las endotoxinas en el organismo.

Cuando las endotoxinas ingresan al torrente sanguíneo o a cavidades estériles del cuerpo, activan el sistema inmunológico innato al interactuar con los receptores tipo Toll (TLR4) presentes en células inmunitarias como los macrófagos. Esta interacción desencadena una cascada inflamatoria que puede generar:

Fiebre (respuesta febril o pirexia)

Hipotensión

Coagulación intravascular diseminada (CID)

Shock séptico

Fallo multiorgánico

La gravedad de los efectos depende de la concentración de endotoxinas en el organismo y del estado inmunológico del individuo. Por esta razón, la detección y control de endotoxinas es fundamental en productos médicos y farmacéuticos.

¡¡¡¡IMAGINATE QUE PASARÍA SI NO SE HICIERAN ESTAS PRUEBAS A LAS VACUNAS QUE TE APLICA CADA AÑO !!!!

DATO CURIOSO: Se estima que una bacteria G(-) posee unas 3,5 * 106 moléculas de LPS que ocupan un área de 4,9 µm2, si la superficie aproximada de una bacteria oscila entre 6-9 µm2 el LPS correspondería a las ¾ partes de la superficie bacteriana.

Principio de la prueba LAL

La prueba LAL (Limulus Amebocyte Lysate) se basa en la capacidad del lisado de amebocitos, extraído de la sangre del cangrejo herradura (Limulus polyphemus), para reaccionar específicamente con endotoxinas bacterianas (lipopolisacáridos de bacterias Gram negativas). Esta interacción desencadena una cascada enzimática que culmina en la formación de un gel o coágulo.

El proceso puede dividirse en tres pasos fundamentales:

Activación del Factor C

1 El lisado contiene el Factor C.

una proteína altamente sensible y que se activa exclusivamente en presencia de endotoxinas. Cuando el lipopolisacárido (LPS) de las endotoxinas entra en contacto con el lisado, el Factor C es activado.

2. Cascada enzimática.

La activación del Factor C desencadena una serie de reacciones enzimáticas secuenciales que activan el Factor B y finalmente el coagulógeno, una proteína soluble que se convierte en coágulo insoluble.

3. Formación del producto.

Dependiendo del tipo de ensayo, el producto final puede ser:

Un gel visible (ENSAYO GEL-CLOT)

Un aumento de turbidez (ENSAYO- TRUBIDIMÉTRICO)

Un cambio de color (ENSAYO CROMOGÉNICO)

Fluorescencia (ENSAYO SINTÉTICO)

Reacción específica y sensibilidad

La prueba LAL es extremadamente sensible y puede detectar niveles de endotoxinas tan bajos como 0.01 hasta 0.005 Unidades Endotóxicas (UE) por mililitro. Esta sensibilidad y especificidad hacen que la prueba sea ideal para el control de calidad de productos farmacéuticos, dispositivos médicos y soluciones inyectables.

Tipos de ensayos LAL.

Los métodos iniciales para esta prueba son el ensayo LAL convencional y versiones mejoradas que aumentan la precisión y la consistencia de los resultados de la prueba. Los tres enfoques más utilizados son:

Prueba de formación de gel (Gel-Clot).

Se caracteriza por la formación de una consistencia gelatinosa cuando está presente una toxina bacteriana.

Es una técnica no cuantitativa, ya que simplemente determina si hay o no endotoxinas presentes.

Su principal aplicación es la liberación por lotes de productos farmacéuticos.

Requiere estrictas condiciones de temperatura y tiempo para asegurar resultados reproducibles.

Prueba turbidimétrica.

El método se basa en la medición del aumento de turbidez asociado a la cantidad de endotoxina, con la ayuda de un software especializado.

Un espectrofotómetro mide el aumento en la absorción de luz a 340 nanómetros.

El sistema proporciona beneficios como la operación automática y la capacidad de examinar numerosas muestras rápidamente.

Ensayo cromogénico.

Utiliza un cromóforo que al entrar en contacto con la endotoxina presenta una coloración amarilla que varía en función de la cantidad de endotoxina.

La prueba determina los niveles de endotoxinas observando un cambio de color específico utilizando una herramienta de medición de luz cuando brilla a un punto de 405 nanómetros, dando números muy precisos.

Es extremadamente delicado y aplicable para artículos con contaminación menor de endotoxinas.

Regulaciones internacionales.

La importancia del ensayo LAL está respaldada por numerosas normas globales que imponen límites a la cantidad aceptable de endotoxinas en productos farmacéuticos y dispositivos médicos. Entre las más relevantes se encuentran:

Farmacopea de los Estados Unidos (USP), Capítulo <85>.

. Farmacopea Europea ( EP), Capítulo 2.6.14.

Farmacopea Japonesa (JP).

Las directivas establecen niveles de endotoxinas adecuados (en Unidades Endotóxicas, UE) y describen estrategias para una ejecución precisa y uniforme del ensayo de amebocitos de Limulus.

Desafíos y avances en la prueba LAL.

Aunque la prueba LAL es efectiva, enfrenta obstáculos, particularmente la varianza natural del lisado y la necesidad imperiosa de proteger al cangrejo herradura amenazado de la recolección de sus células sanguíneas. Para enfrentar estos obstáculos, se han creado alternativas como el ensayo de Factor C recombinante (rFC), una versión sintética del Factor C que se encuentra en los amebocitos del Limulus. Este enfoque mejora la reproducibilidad y elimina la necesidad de capturar criaturas reales.

Conclusión

El análisis LAL, se erige como un punto de referencia en la identificación de lipopolisacáridos bacterianos, contribuyendo notablemente a la seguridad de los productos farmacéuticos y el equipo médico. Con el progreso moderno y la creación de sustitutos ecológicos, se anticipa que esta técnica seguirá adaptándose y siendo punta de lanza en el aseguramiento de la calidad y la defensa del bienestar humano.

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